ACE基因的多態(tài)性.ppt

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1、實(shí)驗(yàn)1頰粘膜上皮細(xì)胞基因組DNA的抽提及ACE基因多態(tài)性分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諒奈⒘縼?lái)源的組織細(xì)胞中抽提基因組DNA掌握PCR技術(shù)原理了解基因多態(tài)性分析的方法。二、原理基因組DNA抽提堿裂解法抽提基因組DNA（本實(shí)驗(yàn)）用蛋白酶K和苯酚提取大分子DNA裂解-蛋白酶K-沉淀法快速提取DNAACE基因多態(tài)性分析PCR方法分析基因多態(tài)性真核生物基因組中非編碼序列多于編碼序列基因組編碼序列非編碼序列調(diào)控序列重復(fù)序列高重復(fù)序列（串聯(lián)排列，大衛(wèi)星、小衛(wèi)星、微衛(wèi)星）中重復(fù)序列（散在分布；部分編碼；Alu家族）低重復(fù)序列或單拷貝Alu家族重復(fù)單位：300bp左右

2、；130+31+130bp具Alu酶切位點(diǎn)30-50萬(wàn)次功能：基因調(diào)控Alu元件的插入、刪除和重組與許多先天性遺傳疾病和癌癥相關(guān)ACE基因多態(tài)性分析(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶,Angiotesinconvertingenzyme,ACE)基因診斷：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的方法，從DNA、RNA水平檢測(cè)基因的存在、結(jié)構(gòu)異常和表達(dá)狀態(tài)，從而對(duì)疾病做出診斷的方法?；蚨鄳B(tài)性：指在一隨機(jī)婚配的群體中，染色體同一基因座位點(diǎn)上有兩種或兩種以上的基因型，它可決定人體對(duì)疾病的易感性、臨床表現(xiàn)多樣性和對(duì)藥物治療反應(yīng)的差異性。理論基礎(chǔ)ACE基因第16內(nèi)含子存在一

3、段長(zhǎng)度為287bp（Alu序列）的插入/缺失（I/D）多態(tài)性片段，I/D多態(tài)性與血液ACE水平有明確關(guān)系，DD型ACE水平最高，ID次之，II最低。左室肥大患者中DD型頻率明顯增高。實(shí)驗(yàn)原理以DNA為模板，ACE基因特異的引物序列位于287bp插入/缺失片段的兩側(cè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，故II型擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為490bp，DD型擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為190bp，ID型擴(kuò)增片段為２個(gè)，分別為190bp和490bp。根據(jù)PCR擴(kuò)增片段的大小可進(jìn)行多態(tài)性分析。插入片段插入型缺失型490bp190bp操作步驟基因組DNA抽提PCR反應(yīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)1.基因組D

4、NA抽提溶液Ⅰ10ml漱口20秒收集漱口水；3000g×5min×RT，棄上清；溶液Ⅱ250ul重懸沉淀；3000g×1min，棄上清；溶液Ⅲ250ul重懸沉淀，振蕩10秒；（變性）轉(zhuǎn)至0.5ml離心管，99℃×5min；加溶液IV50ul振蕩5秒；（中和）3000g×1min，上清轉(zhuǎn)移至新0.5ml離心管，取5ul用于PCR.2.PCR反應(yīng)取消毒的0.5ml離心管，加入下列成分：10×PCRBufferdNTP(2.5mMeach)mix:10μlTaqDNApolymeraseDNA模板5μl引物混合物(10μMeach)2μlddH2O

5、3μl總體系20μl擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸40s，共反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。瓊脂糖電泳檢測(cè)制備1％瓊脂糖凝點(diǎn)樣，電泳紫外燈下觀察結(jié)果ACE基因多態(tài)性電泳圖2k1k750bp500bp250bp100bp