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1、實時熒光定量PCR方法簡介一．實時熒光定量PCR的基本原理理論上，PCR過程是按照2n（n代表PCR循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)的方式進行模板的擴增。但在實際的PCR反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)的進行由于體系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰減）使得靶序列并非按指數(shù)方式擴增，而是按線性的方式增長進入平臺期。因此在起始模板量與終點的熒光信號強度間沒有可靠的相關(guān)性。如采用常規(guī)的終點檢測法（利用EB染色來判斷擴增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量），即使起始模板量相同經(jīng)PCR擴增、EB染色后也完全有可能得到不同的終點熒光信號強度
2、。為了能準確判斷樣品中某基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）的起始拷貝數(shù)，實時熒光定量PCR采用新的參數(shù)——Ct值，定量的根本原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關(guān)系。Ct值是如何得到的在實時熒光定量PCR的過程中，靶序列的擴增與熒光信號的檢測同時進行，定量PCR儀全程采集熒光信號，實驗結(jié)束后分析軟件自動按數(shù)學(xué)算法扣除熒光本底信號并設(shè)定閾值從而得到每個樣品的Ct值。Ct值的定義Ct值中的“C”代表Cycle（循環(huán)），“t”代表檢測threshhold（閾值），其含義是PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需
3、要的循環(huán)數(shù)；也可以理解為擴增曲線與閾值線交點所對應(yīng)的橫坐標。Ct值與樣品中模板的對應(yīng)關(guān)系Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關(guān)系（y=ax+b，x代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)，y代表Ct值）。與終點法相比利用Ct值的優(yōu)勢由于Ct值是反映實際PCR反應(yīng)過程中擴增即將進入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的影響，因此利用Ct值判斷的起始模板拷貝數(shù)更加精確，重復(fù)性也更好。傳統(tǒng)的終點檢測法是在PCR擴增經(jīng)歷了指數(shù)擴增期進入平臺期后利用EB等染料染色來判斷擴增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量，這種方法的
4、精確度不高、重復(fù)性也不好。下圖中是96個復(fù)孔的實時擴增曲線（完全相同的反應(yīng)體系、相同的反應(yīng)protocol、相同的樣品起始濃度），可以看到Ct值具有很好的重復(fù)性，而終點的熒光信號強度差異達到300個單位。此外，采用實時熒光定量PCR還能從方法學(xué)上有效的防止PCR實驗中交叉污染的問題。因為熒光定量PCR中模板的擴增與檢測是同時進行的，當實驗完成后即可獲得定量結(jié)果，直接丟棄含有大量擴增產(chǎn)物的反應(yīng)管，徹底避免了傳統(tǒng)方法中取出擴增產(chǎn)物進行電泳鑒定時擴增產(chǎn)物對實驗室造成二次污染的可能性。一．熒光定量PCR的2類方法（按熒
5、光產(chǎn)生的原理分類）染料法（SYBRGreen法）染料法即利用SYBRGreen分子產(chǎn)生的熒光信號來進行樣品定量。該方法與常規(guī)的PCR類似，唯一的區(qū)別是在反應(yīng)體系中加入了SYBRGreen染料分子。該染料分子的激發(fā)波長為497nm，發(fā)射波長為520nm。與EB的性能類似，SYBRGreen也是一種扁平狀的分子，處于游離狀態(tài)時具有很低的熒光本底，當反應(yīng)體系中存在dsDNA時，SYBRGreen能特異性的與之結(jié)合并在497nm激發(fā)下。染料法的優(yōu)點：1，無需設(shè)計、合成探針，實驗成本低；2，使用方便，與常規(guī)PCR的操作幾
6、乎相同。染料法的缺點：1，由于SYBRGreen與dsDNA的結(jié)合只具有結(jié)構(gòu)特異性而不具有序列特異性，除了與特異性的靶序列擴增產(chǎn)物結(jié)合外，還能與在PCR擴增過程中形成的引物二聚體、非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合，從而造成擴增效率的降低、結(jié)果的不準確。因此采用該方法對于引物的設(shè)計及實驗條件的優(yōu)化要求很高，確保反應(yīng)過程中沒有非特異性產(chǎn)物的擴增；2，由于SYBRGreen的上述特點，該方法不能應(yīng)用于MultiplexQPCR技術(shù)。（在一個反應(yīng)管中同時檢測多個目的基因的表達情況）探針法（以TaqMan探針為例）探針法熒光定量PC
7、R與常規(guī)PCR的不同之處在于：在上、下游引物外還加入了具有序列特異性的探針（探針本身具有熒光標記），該探針根據(jù)需要擴增的靶序列設(shè)計因此只能與待檢測序列結(jié)合，與染料法相比提高了實驗的特異性。目前市場上的探針主要種類有：TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探針應(yīng)用最廣泛。TaqMan探針的結(jié)構(gòu)：長度與普通PCR引物類似，大約20bp左右。在5’與3’端各標記有一個熒光基團，5’的熒光基團稱為報告基團（Report），3’的熒光基團稱為淬滅
8、基團（Quencher）。TaqMan探針的性能：在探針結(jié)構(gòu)完整的情況下用特定的波長激發(fā)報告基團，由于報告基團與淬滅基團的空間位置很近，因此報告基團能夠通過FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）將接受的能量轉(zhuǎn)移到淬滅基團，使后者以發(fā)射熒光或熱量的方式釋放能量，而報告基團并不發(fā)射特定波長的熒光信號。TaqMan探針法工作原理：?變性（95°C）
