血小板生長(zhǎng)因子對(duì)新生鼠缺血缺氧性腦損傷保護(hù)作用

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1、血小板生長(zhǎng)因子對(duì)新生鼠缺血缺氧性腦損傷保護(hù)作用【摘要】目的探討血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)對(duì)新生鼠缺血缺氧性腦損傷(HIBD)的保護(hù)作用。方法7日齡ethodsThisstudyconsistedof72ANCOULTERFC500流式細(xì)胞儀，LD52A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠制造)，日本OLYMPUS熒光顯微鏡，200目不銹鋼細(xì)胞篩。　　1.2實(shí)驗(yàn)方法　　1.2.1新生大鼠HIBD模型制備治療組和對(duì)照組制備HIBD模型。取7日齡L/kg麻醉后，仰臥固定于手術(shù)板上，用安爾碘局部消毒皮膚。于右側(cè)頸動(dòng)脈區(qū)作一長(zhǎng)約1cm切口，逐層分離皮下組織，暴露并游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，0號(hào)線結(jié)

2、扎右頸總動(dòng)脈，一次性縫合線縫合切口。待術(shù)后蘇醒將大鼠放入自制的新生大鼠缺氧裝置中，以2L/min的流量輸入體積分?jǐn)?shù)0.08O2+體積分?jǐn)?shù)0.92N2的混合氣體，環(huán)境溫度為36～37℃,低氧處理2h后取出返回母鼠身邊繼續(xù)喂哺。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，不予結(jié)扎及低氧處理?！　?.2.2干預(yù)措施治療組于模型建立后30min內(nèi)腹腔注射PDGFBB50ng/kg，假手術(shù)組和對(duì)照組在相同時(shí)間腹腔注射等量生理鹽水?！　?.2.3標(biāo)本的制備3組大鼠分別于術(shù)后12、24、72h以100g/L水合氯醛過(guò)度麻醉處死，斷頭，取右側(cè)大腦半球腦組織用生理鹽水洗去表面血污，無(wú)菌剪刀將其剪成1m

3、m3小塊，放到200目(相當(dāng)于孔徑80μm)不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上，用無(wú)菌玻璃試管擠壓腦組織塊，PBS液輕輕吹打細(xì)胞網(wǎng)篩，濾過(guò)液再經(jīng)40μm細(xì)胞篩過(guò)濾，即成單細(xì)胞懸液。單細(xì)胞懸液再經(jīng)過(guò)PBS液洗滌1～2次,取1mL細(xì)胞(密度5×108/L～1×109/L)用FITC和PI雙染(方法參照AnnexinⅤ試劑盒說(shuō)明書),40g/L多聚甲醛2～3mL固定，4℃避光保存?！　?.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)法:將40g/L多聚甲醛固定的單細(xì)胞懸液用冷的PBS液洗1～2次，用PBS液使細(xì)胞懸浮，即可上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,計(jì)數(shù)104個(gè)細(xì)胞?！　?.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)

4、±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！　?結(jié)果　　假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異(P>0.05)，術(shù)后12、24、72h對(duì)照組和治療組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均逐漸增加，差異有顯著意義(F=130.35、78.83，q=5.07～19.46，P<0.01)。各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和治療組較假手術(shù)組腦細(xì)胞凋亡率顯著增加，治療組較對(duì)照組腦細(xì)胞凋亡率顯著減少，差異有顯著意義(F=39.01～194.20，q=3.08～16.51，P<0.01)。見表1。表1各組術(shù)后不同時(shí)間右側(cè)大腦半

5、球神經(jīng)細(xì)胞凋亡率　　3討論　　HIBD極期對(duì)癥支持治療及隨后的腦細(xì)胞代謝激活劑、促進(jìn)神經(jīng)纖維修復(fù)藥物的應(yīng)用已達(dá)成共識(shí)。針對(duì)發(fā)病機(jī)制的各個(gè)環(huán)節(jié)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)HIBD的治療作了大量的研究，如基因治療、神經(jīng)干細(xì)胞移植、氧自由基清除劑、鈣離子通道阻滯劑和細(xì)胞因子的應(yīng)用等，都尚在探索研究階段。近年來(lái)，很多研究支持PDGF具有神經(jīng)保護(hù)作用[25]?！　?.1HIBD與細(xì)胞凋亡　　ZHANG等[6]研究顯示，缺血低氧后不成熟大腦室管膜下神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生不同程度的損傷。神經(jīng)元和少突細(xì)胞祖細(xì)胞較神經(jīng)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞受損更為嚴(yán)重。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明缺血低氧可引發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡在HIB

6、D中呈動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。神經(jīng)細(xì)胞急性壞死的同時(shí)，凋亡即已發(fā)生，在缺血低氧后4d，細(xì)胞急性壞死減少或停止，凋亡仍然發(fā)生，直至1～2周以后[7]。細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(ps)外翻，ps與熒光探針特異性結(jié)合，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)凋亡細(xì)胞?！　?.2PDGF的神經(jīng)保護(hù)作用　　PDGF是由多種細(xì)胞產(chǎn)生能刺激成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等增生的多肽，具有廣泛的生理活性。它是由A、B兩條多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成的同型或異型二聚體，包括PDGFAA、PDGFBB、PDGFAB等3種形式，其相對(duì)分子質(zhì)量為2.8萬(wàn)～3.5萬(wàn)。PDGF生物學(xué)特征主要有分裂效應(yīng)、縮血

7、管活性和趨化活性，它以自分泌、旁分泌的方式發(fā)揮作用。PDGF受體由α、β兩種亞基構(gòu)成3種二聚體，PDGF發(fā)揮作用必須與靶細(xì)胞上的受體相結(jié)合。近年來(lái)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDGF及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，它參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟等過(guò)程，在不同發(fā)育時(shí)期的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，PDGF在神經(jīng)變性、腦缺血缺氧性損傷等疾病中發(fā)揮重要的作用。PDGF及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，在損傷、缺血低氧、炎癥時(shí)表達(dá)增多[811]。OHNO等[9]研究結(jié)果顯示，HIBD誘導(dǎo)神經(jīng)元的PDGFBB和β受體水平迅速升高，提示PDGFBB分子