肺炎衣原體感染的診斷與其應(yīng)用

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1、論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)F進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。論文中除了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的聲明并表示的謝意。作者簽名!塑塑論文使用授權(quán)聲明13期：M稠一、本人完全了解復(fù)旦大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此規(guī)定。作者簽名：聾盟導(dǎo)師簽名：盟B甄、w刁磊。r復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要肺炎衣原

2、體(Chlamydiapneumoniae，Cpn)作為衣原體屬的一種重要的呼吸道病原微生物，自從上個(gè)世紀(jì)80年代中期正式命名以來得到了研究者們的廣泛重視。所致疾病最常見的是肺炎和支氣管炎，近年來諸多研究表明其與動脈粥樣硬化綜合癥，老年癡呆癥等疾病有關(guān)。Cpn分布極其廣泛，大約有50．80％的成人血清可檢出抗體。在我國，與Cpn感染相關(guān)的疾病發(fā)生率呈逐年上升趨勢。目前檢測Cpn的多種方法均存在一定的不足之處。因此，我們試通過制備針對Cpn的單克隆抗體(Monoclonalantibody，McAb)，建立直接免疫熒光法(DirectImmunofluoresc

3、enceAssay，DIF)，同時(shí)應(yīng)用巢式聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)與核酸雜交(SouthernBlotting)方法，檢測人外周血單核細(xì)胞(PeripheralBloodMononuclcarCell，PBMC)中Cpn抗原和核酸。通過對以上檢測結(jié)果的比較，較客觀的評定每種方法的特異性和敏感性，以便用于輔助Cpn感染的臨床診斷，分析Cpn感染與疾病的因果關(guān)系。論文第一部分主要內(nèi)容是，以進(jìn)口Cpn抗原免疫BALB／C小鼠，將免疫的小鼠脾臟細(xì)胞與SP2／O細(xì)胞融合，并用間接酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-LinkedIm

4、munoadSorbentAssay，ELISA)篩選抗體陽性雜交瘤細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟細(xì)胞與SP2／0細(xì)胞的融合率為61．46％(236／384)。經(jīng)克隆化及篩選后，最終獲得4株穩(wěn)定分泌CpnMeAb的細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞接種小鼠后，收集小鼠腹水MeAb，經(jīng)純化后用間接ELISA檢測抗體效價(jià)，效價(jià)高者可達(dá)1：106；免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定MeAb為IgG類；微量熒光免疫試驗(yàn)(Micro．immunofluorescenceAssay,MIF)檢測McAb種屬特異性發(fā)現(xiàn)，與鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci，Cps)出現(xiàn)一定程度的交叉反應(yīng)，而與沙眼

5、衣原體(Chlamydiatrachomatis，Ct)則無交叉反應(yīng)，此結(jié)果與進(jìn)口CpnMeAb一致。Dot-ELISA顯示獲得的單抗與39．5KD克隆表達(dá)的重組Cpn主要外膜蛋白(MajorOuterMembraneProtein,MOMP)呈陽性結(jié)合反應(yīng)，為CpnMOMP特異性MeAb。論文第二部分是以FITC自行標(biāo)記自制CpnMcAb，其熒光素與蛋白的比值if／P)為2．28，成功獲得熒光素標(biāo)記的McAb。用自制ClanMeAb與進(jìn)口ClmMcAb，建立了直接免疫熒光法(DIF)。用DIF同時(shí)檢測240份PBMC標(biāo)本的Cpn抗原，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果顯示

6、，兩種McAb檢測結(jié)果均陽性的共86份，SPSS軟件分析自制ClanMcAb的特異性和敏感性均與進(jìn)口McAb具有中等一致性?？捎米灾芃eAb替代進(jìn)口McAb檢測Cpn抗原，以輔助Cpn感染的臨床診斷。與進(jìn)口McAb相比，自制MeAb同樣具有敏感性和特異性，且有方便、價(jià)廉的特點(diǎn)。以fl$0CpnMcAb對動脈粥樣硬化等心血管疾病和某些呼吸道疾病組標(biāo)本作Cpn抗原檢測，陽性檢出率分別為69．34％(95／137)和72．06％(49／68)，2復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文分別與正常對照組進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果證實(shí)均具顯著性差異。提示對于動脈粥樣硬化等某些疾病的發(fā)生和發(fā)展，Cp

7、n感染可能是重要的原因之一，但其中的因果關(guān)系還有待深入研究。論文第三部分通過設(shè)計(jì)Cpn特異性雙引物，建立了巢式PCR檢測方法，并對該方法進(jìn)行了相關(guān)評價(jià)，發(fā)現(xiàn)具有很好的特異性和敏感性。在對240份PBMC標(biāo)本進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測中，呈陽性的有74．17％(178／240)，比DIF的陽性檢出率略高，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，呼吸道疾病PBMC標(biāo)本中，巢式PCR的陽性檢出率為79．41％(54／68)，心血管疾病PBMC標(biāo)本的則為75．18％(103／137)。通過Oligo6．0軟件設(shè)計(jì)針對巢式PCR第二步擴(kuò)增產(chǎn)物，設(shè)計(jì)特異性DIG標(biāo)記探針，建立了核酸雜交(South

8、ernBlotting)試驗(yàn)，對24份