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《兒童耐多藥結(jié)核桿菌差異表達基因的篩選及克隆》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、重慶醫(yī)科大學碩士學位論文兒童耐多藥結(jié)核桿菌差異表達基因的篩選及克隆姓名：張運玲申請學位級別：碩士專業(yè)：兒科學指導教師：朱朝敏201205兒童耐多藥結(jié)核桿菌差異表達基因的篩選及克隆摘要目的：本研究擬避開傳統(tǒng)在已知結(jié)核菌耐藥相關(guān)基因中一一進行探索的實驗方法，直接從基因差異表達角度入手，就可能參與調(diào)控結(jié)核菌耐多藥性產(chǎn)生的基因進行一次橫向、大范圍的篩選；了解兒童結(jié)核桿菌耐多藥調(diào)節(jié)機制與成人的異同點。方法：收集我院感染消化科從2003年7月"-'2010．12月所有培養(yǎng)陽性的結(jié)核菌株，在已進行耐藥鑒定和基因分型的基礎(chǔ)上，以耐多藥菌株cDNA為實驗組(Te
2、ster)，敏感株cDNA為驅(qū)動組(Driver)，應用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)結(jié)合T／A克隆技術(shù)構(gòu)建族耐多藥與敏感菌株差異表達消減cDNA文庫，利用Blastn軟件將所獲得的表達序列標簽(EST)序列與公共數(shù)據(jù)庫GenBank進行同源性分析。結(jié)果：經(jīng)過兩次消減雜交及PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)“A／Tclone”克隆到PMD-18T載體，轉(zhuǎn)染至感受態(tài)大腸桿菌DH5，所長出的菌落中約9(P／o為白色菌落，成功構(gòu)建耐多藥結(jié)核桿菌cDNA消減文庫。經(jīng)PCR鑒定約80％有特異性擴增帶且擴增帶分子量在200，--1000bp之間，陽性率較高。隨即挑選248個
3、陽性克隆進行基因測序，經(jīng)同源性分析去除無效及重復序列，共獲得113個差異表達cDNA片段，其中有5條未知EST序列，其余108個均為已知基因(5個參與結(jié)核耐藥的形成)，其主要'功能分類主要為：①細胞壁及相關(guān)過程蛋白基因，如Rv0987，Rv3783，Rv2318；@PPE家族蛋白相關(guān)基因，如Rv3343cPPE54，Rvl918cPPE35：③參與中間代謝和呼吸活動相關(guān)基因，如Rv3858cRv3784，Rv3068c：④與結(jié)核桿菌毒力，解毒作用及其適應性相關(guān)基因，如Rv2477cRv0783cRv2303c；⑤細菌脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，如Rv29
4、33Rv2931Rv3515c；⑥調(diào)控相關(guān)蛋白，如Rv3765cRv2799cRv0984；⑦假想蛋白，如Rvl498ARv2603Rv0690c及一些信號通路、調(diào)節(jié)蛋白和插入序列等。結(jié)論：研究表明SSH技術(shù)是篩選差異表達基因和新功能基因的有效方法；多種已知或未知基因均參與了結(jié)核桿菌耐多藥的調(diào)節(jié)，大規(guī)模篩選與克隆這些基因為進一步研究結(jié)核桿菌耐多藥機制的產(chǎn)生奠定了必要的理論基礎(chǔ)，可能為新的臨床診斷方法的建立提供相應靶點；已知耐藥相關(guān)基因中未發(fā)現(xiàn)兒童與成人結(jié)核耐多藥調(diào)節(jié)機制的差異。關(guān)鍵詞：結(jié)核桿菌；抑制消減雜交；耐多藥；差異表達基因SCREENIN
5、GANDCLON礬GDⅡrERENTLALLYEXPRESSEDGENESOFCHILDRENMULTI-DRUGI之ESITf蝌CETUBERCULoSIsABSTRACTObjective：Inthisstudy，weaimedtoscreenfordifferentiallyexpressedgenesinmultidrug—resistanttuberculosis(IVIDR—TB)anddrug-sensitiveTB，toidentifythosegenesthathaveeffectsonMDRinTBandtodiscusst
6、hemechanismsofgeneregulationinMDRinTB．Methods：Ininfectionsandgastroenterologydepartment，Wecollectedtheculture-positivembercubsisstrainsfrom2003．7～2010．12．Inthebasisofgenotypinganddmgidentification，thecDNAfromanMDRstrainofTBwasusedastheexperimentalgroup(Tester)，whiletheeDNAfr
7、omasensitivestrainofTBwasusedasthecontrol(Driver)．Suppressionsubtmctivehybridization(SS均technologyWasusedincombinationwithmeT／AfamilyofcloningtechnologytobuildalibraryofcDNAsthatweredifferentiallyexpressedintheMDRandsensitivestrains．FromthiseDNAlibrary,genesthatwereexpressed
8、intheMDR．TBbutnotinthedrug-sensitiveTBwereselectedforgenesequencingandhomol
