中國漢族hla-cw基因多態(tài)性及測序分型技術(shù)的研究與應(yīng)用

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1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文中國漢族HLA-Cw基因多態(tài)性及測序分型技術(shù)的研究與應(yīng)用姓名：鄧志輝申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：徐安龍20090910中山大學(xué)博士論文：中國漢族HLA．Cw基因多態(tài)性及測序分型技術(shù)的研究與應(yīng)用中國漢族HLA—Cw基因多態(tài)性及測序分型技術(shù)的研究與應(yīng)用專業(yè)：生化與分子生物學(xué)博士研究生：鄧志輝導(dǎo)師：徐安龍教授摘要經(jīng)典的HLA-Cw分子不僅呈遞內(nèi)源性抗原，而且作為殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KillerImmunoglobulin-likeReceptor,KIR)的配體，在調(diào)節(jié)NK細胞(NaturalKillercel

2、ls)的殺傷功能中起重要作用。隨著HLA．Cw分子生物學(xué)功能、HLA—Cw基因與疾病，以及HLA-Cw基因與移植相關(guān)性等研究的開展和深入，人們對肌A-Cw基因的傳統(tǒng)錯誤認識被逐漸打破。當(dāng)前HLA-Cw等位基因多樣性、全長序列SNPs多態(tài)性及表達調(diào)控的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究正悄然升起。為此，我們進行如二A．Cw等位基因多樣性、全長序列SNPs遺傳多樣的研究，基于所獲取的全長序列，建立可靠的、適合于中國人群的高通量化HLA-Cw基因測序分型方法，該方法可用于骨髓庫造血干細胞的HLA入庫數(shù)據(jù)常規(guī)檢測、中國人群HLA．Cw基因群體遺傳學(xué)和組織配型等相關(guān)的研究和應(yīng)用工作。H

3、LA-Cw等位基因多樣性研究，本文首先對100份新疆維吾爾族隨機個體的血樣進行了HLA-Cw基因的第2和第3外顯子測序分型，排除罕見等位基因后，出現(xiàn)模棱兩可結(jié)果的比例占37％。共檢出了27種等位基因，其中頻率大于10％的2種常見等位基因為Cw*0602和Cw*0102。按與KIR分子識別方式的不同，第1組Cw木01，03，07，08，12，14和第2組Cw*02，04，05，06，15，16，17，18的頻率IV中山大學(xué)博士論文：中國漢族HLA．Cw基因多態(tài)性及測序分型技術(shù)的研究與應(yīng)用分別為0．61和0．40，其頻率的分布不同于漢族人群。我們在后來增加的2

4、9份維吾爾族隨機捐血者樣本檢測時，檢出了一個Cw*040105新等位基因。其次是調(diào)查漢族人群HLA-Cw基因的分子遺傳多態(tài)性，篩選、發(fā)現(xiàn)和鑒定可能的HLA新等位基因，探討商品化試劑盒的PCR引物、測序引物與中國人群的匹配性，將所獲得的HLA-Cw基因測序分型結(jié)果供骨髓移植患者查詢和檢索。共對734份漢族骨髓志愿捐獻者樣本采用AtriaAlleleSEQRHLA-CwPlus商品化試劑盒進行HLA-Cw基因第2、第3和第4外顯子測序分型，共檢出了41種等位基因，頻率大于10％的3種常見等位基因為：Cw*0102>Cw*0702>Cw*0304，基因的多樣性(

5、DP)達0．9281，實際觀察雜合度(H)為0．9196(675／734)，純合子樣本比例占8．04％，表明漢族人群HLA-Cw基因為高度多態(tài)性位點。漢族HLA-Cw分子第1組Cw*01，03，07，08，12，14與第2組Cw*02，04，05，06，15，16，17，18組的頻率分別為0．8243和O．1758，與KIR識別以HLA-Cw分子第1組為主。734份漢族個體經(jīng)AtriaAUeleSEQRHLA-CwPlus商品化試劑盒檢出了8例PCRoSBT結(jié)果“異?！钡臉颖?，經(jīng)分子克隆和單倍體測序，在1個樣本中檢出了Cw*0624新等位基因，另外的2個無

6、關(guān)個體樣本中均檢出了Cw*075602新等位基因。其余的5例樣本經(jīng)分子克隆測序以及自行設(shè)計的PCR引物再測序，證實了這5例標本用Atria商品化試劑盒初次檢測結(jié)果中，均存在Cw*0706等位基因漏檢和丟失現(xiàn)象，未檢出新等位基因。我們總結(jié)了這5例樣本等位基因漏檢和丟失的一般特點，闡明等位基因丟失的原因。這5例樣本等位基因漏檢和丟失現(xiàn)象提示：對HLA-Cw分子進行全長序列測定，在豐富和增加國際IMGT／HLADatabase數(shù)據(jù)庫中國人群HLA-Cw基因全長序列等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的同時，建立適合于中國人群的測序分型方法十分必要。為此，我們采用長距離PCR技術(shù)和Pfu酶

7、，擴增HLA-Cw基因的全長目的全長序列片段4．5kb，同時設(shè)計了12條測序引物進行全長序列雙向測序。對28個漢族個體樣本，我們共檢測出22種等位基因，均向GenBank遞交序列；其中Cw*0706，Cw*030301，Cw*140201的全長序列為首次報道，尤其是Cw*0706內(nèi)V中山大學(xué)博士論文：中國漢族HLA．Cw基因多態(tài)性及測序分型技術(shù)的研究與應(yīng)用含子序列的獲得，使得我們能夠重新設(shè)計對該等位基因測序分型的引物，解決Atria商品化測序分型試劑盒對這一等位基因漏檢的問題。利用群體遺傳學(xué)分析方法，將所得HLA-Cw56條序列用clustal軟件進行序列

8、排比，輸入到DnaSP4．0進行多態(tài)性分析，共發(fā)現(xiàn)244個SNPs