綿馬素bb體外抗金黃色葡萄球菌活性及其作用機制研究

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1、萬方數(shù)據(jù)UniversityCode：10225RegisterCode：S14685DissertationfortheDegreeofMasterInvestigationofantibacterialactivityandmechanismofaspidinBBagainstStaphylococcusaureusinvitroCandidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：University：L1NaProf．FuYuji

2、eMasterPharmacognosyJune，2014NortheastForestry萬方數(shù)據(jù)摘要

3、

4、IIIIIIIIIIIIIIIIIY2720857香鱗毛蕨屬于鱗毛蕨屬的一種，歷來在民間用于治療各種皮膚病，如痤瘡，銀屑病，皮疹和皮炎等。綿馬素BB是從香鱗毛蕨中提取的典型的間苯三酚類衍生物，具有抗癌，抗蠕蟲，抗病毒和抗菌等活性，但其抗菌機制至今尚未報道過。通過對綿馬素BB體外抗菌活性進(jìn)行初步篩選，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗金黃色葡萄球菌的活性，同時對正常細(xì)胞毒性較低，因而具有很好的開發(fā)前景。本文主要以綿馬素BB為研究對象，研究其在體外對金黃色葡萄球菌的抗菌活性和其抗菌分子作用機制

5、。研究結(jié)果如下：1．綿馬素BB對金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌活性。采用肉湯稀釋法及動態(tài)殺菌曲線考察綿馬素BB對金黃色葡萄球菌(含標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株)的抗菌活性，結(jié)果表明，綿馬素BB具有良好的抗金黃色葡萄球菌的活性，對一標(biāo)準(zhǔn)株和三株臨床株的MIC值分別為15．63I．tg／mL，62．5I，tg／mL，31．2599／mL和31．251ag／mL；MBC值分別為31．25、125、62．5、62．5gg／mL。動態(tài)殺菌曲線的結(jié)果表明，綿馬素BB能夠在MBC的濃度下，4小時內(nèi)將金黃色葡萄球菌完全殺滅，并且其抑菌及殺菌活性具有一定的濃度及時間依賴性。2．綿馬素BB對非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero

6、)無細(xì)胞毒性。采用MTT法評估綿馬素BB的細(xì)胞毒性，作用72小時后，綿馬素BB對tI@H綠猴腎細(xì)胞(Vero)的IC50值為48．14±1．52pM(22．11±0．70pg／mL)，表明，綿馬素BB對正常細(xì)胞株的毒性較小，且當(dāng)金黃色葡萄球菌死亡時，綿馬素BB不會對正常細(xì)胞造成損傷。3．綿馬素BB通過調(diào)節(jié)ROS依賴的關(guān)鍵酶的作用，使胞內(nèi)ROS量升高，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的膜破裂，DNA和蛋白質(zhì)降解，最終引起金黃色葡萄球菌死亡。(1)采用酶標(biāo)儀檢測調(diào)控ROS量的酶和非酶物質(zhì)的變化及ROS量的變化。結(jié)果表明，綿馬素BB能夠顯著增強NADPH氧化酶的活性，同時降低SOD(superoxi

7、dedismutase)的活性和GSH(glutathione)的量，從而導(dǎo)致ROS(reactiveoxygenspecies)的水平升高。同時抗氧化劑catalase的使用，可降低ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而提高金黃色葡萄球菌的生存率。這些結(jié)果表明ROS是綿馬素BB發(fā)揮抗金黃色葡萄球菌作用的重要調(diào)控者。(2)綿馬素BB能夠使金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜發(fā)生破裂。原子力顯微鏡在納米級水平下檢測了綿馬素BB與金黃色葡萄球菌作用前后的形態(tài)學(xué)變化。隨著綿馬素BB濃度的增加，細(xì)菌的破壞程度加大，細(xì)胞膜出現(xiàn)不規(guī)則性，最后膜完整性喪失，導(dǎo)致胞質(zhì)溢出，細(xì)菌尺寸變小，RMS粗糙度增加。同時，膜完整性測定、上清蛋

8、白質(zhì)的釋放及脂質(zhì)過氧化測定表明綿馬素BB對金黃色葡萄球菌膜的破壞程度呈時間及濃度依賴性上升。(3)綿馬素BB能夠使金黃色葡萄球菌中DNA發(fā)生裂解。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明，加入綿馬素BB后的金黃色葡萄球菌的泳道內(nèi)出現(xiàn)明顯的DNA破碎。萬方數(shù)據(jù)摘要(4)綿馬素BB能夠使金黃色葡萄球菌中蛋白質(zhì)發(fā)生降解。SDS．PAGE的結(jié)果表明，綿馬素BB可能是通過抑制金黃色葡萄球菌中的SarA(14．718kDa)，F(xiàn)ib(18．765kDa)，ferritin(19．589kDa)，ATP—dependentclpproteolyticsubunit(21．514kDa)，SOD(Mn／Fe)(

9、23．041kDa)，staph)rloxanthinbiosynthesisprotein(33．376kOa)，SeXpheromone(45．381kOa)，Iron—regulatedsurfacedeterminantproteinB(72．192kDa)andH(100．847kOa)蛋白而起作用的。綜上所述，綿馬素BB是通過激活NADPH氧化酶的活性同時抑制SOD的活性及GSH的含量來誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜、DNA和蛋白質(zhì)，最后導(dǎo)致細(xì)菌死亡。這些結(jié)果為綿馬