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《western blot總結(jié)前人的經(jīng)驗.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、Westernblot1.實驗的原理2.試劑的配制3.實驗的步驟4.凝膠圖象分析實驗的原理實驗室所用的試劑的配方參考TAKARA分子實驗常用配方手冊試劑的配制蛋白樣品的制備SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色實驗的步驟蛋白樣品的制備參考RIPA裂解液的說明書：對于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：1.取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，PMSF的工作濃度為1X2.對于貼壁細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗兩遍。加入適量的裂解液（約為細(xì)胞體積的5-7倍），用移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。冰上放置20m
2、in，14000g離心10分鐘，取上清，即為蛋白提取物。3.對于懸浮細(xì)胞，2500g離心5min收集細(xì)胞，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞，2500g離心5min收集細(xì)胞,加入適量裂解液.（約為細(xì)胞體積的5-7倍）。用移液器吹打數(shù)下，把細(xì)胞吹散，冰上孵育20min，14000g離心10分鐘，取上清，即為蛋白提取物。對于組織樣品：1.手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，洗凈組織血跡，用濾紙吸干組織表面液體，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入勻漿器中。2.取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PM
3、SF的最終濃度為1x。3.按組織凈重（g）：裂解液(ml)=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量)。4.勻漿器勻漿,冰上孵育20min，直至充分裂解。5.充分裂解后,14000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提蛋白濃度的測定使用BCA法測，詳細(xì)步驟參考說明書:(1)取1.2ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)（30mgBSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后可立即使用，也可-20℃長期保存；(2)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：
4、取適量25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至0.5mg/ml(蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但為了簡便起見，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品)。稀釋后的0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)也可-20℃長期保存；(3)配制BCA工作液：按50體積試劑A加1體積試劑B配制適量工作液，充分混勻（配制的量視樣本量而定，200μl/孔）。工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。(4)加標(biāo)準(zhǔn)品：將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中（做副孔），加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補足到20μl。(5)加樣品：加2μl樣品到96孔板的樣
5、品孔中，加18μlPBS(好用1%SDS或裂解液，保持與原樣本中的一致)，使總體積達(dá)到20μl。(6)加工作液：每孔加入200μl步驟2所配制工作液。(7)37℃靜置20-30分鐘。可室溫放置2小時。(8)酶標(biāo)儀測定A562，540-595nm之間的波長也可接受。(9)EXCEL繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的蛋白濃度。附SDS－PAGE電泳不連續(xù)的電泳緩沖體系。SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小?！維DS-PAGE基本原理】SDS-PAGE是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和
6、含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)SDS：陰離子去污劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與SDS充
7、分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點：（1）具有相同的形狀，形狀像一個長橢圓棒 （2）平均1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS（3）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比SDS-PAGE凝膠的有效分離范圍SDS－PAGE電泳詳細(xì)過程（1）清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦
8、洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干（2）灌膠與上樣1、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）2、根據(jù)蛋白大小配制一定濃度的分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用1m
