簡并引物設計方法與技巧.ppt

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1、引物設計引物引物的重要性引物設計的原則引物與PCR引物設計軟件如何使用PrimerPremier5.0引物同源性分析引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補?！?’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer引物的重要性在整個PCR體系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對

2、引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結(jié)果密切相關。引物設計原則引物長度堿基分布的均衡性Tm值引物二級結(jié)構(gòu)引物3’端引物5’端引物的內(nèi)部穩(wěn)定性引物的保守性與特異性擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)引物長度一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時應使用較長的引物，但最多不超過50個核苷酸。堿基分布的均衡性同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應超過5個GC含量一般40-60%GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。引物Tm值一般要求：55℃

3、-65℃。計算：對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設計軟件最常用的計算方式。Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15引物二級結(jié)構(gòu)引物二聚體盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補發(fā)夾結(jié)構(gòu)尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。引物3’端引物的延伸從3’端開始，因此

4、3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增完全失敗。考慮到密碼子的簡并性，引物3’端最后一個堿基最好不與密碼子第三個堿基配對。引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列（酶切位點5’端加上適當數(shù)量的保護堿基）。5’端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。5’端標記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。引物的內(nèi)部穩(wěn)定性過去認為，引

5、物3’端應牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進行延伸，故3’端最好為G或C。現(xiàn)在的觀點認為，引物的5’端應是相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3’端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。僅僅3’端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3’端幾個堿基與模板互補結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。引物的保守性與特異性保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別特異性：避免非特異性擴增擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)模板DNA的某些

6、區(qū)域具有高度復雜的二級結(jié)構(gòu)，在選擇引物時，應使擴增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。擴增區(qū)域的自由能（△G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30℃Tmproduct=81.5+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))+0.41(%G+%C)-500/length引物與PCR引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L引物濃度(uM)=nOD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2OVH2O(單位：L)退火溫度最適退火溫度（TaOpt

7、）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。引物設計軟件PrimerPremier5.0生物軟件網(wǎng)下載安裝后，用文本編輯器打開WIN.INI，將vspace=DU改為vspace=PU便可以使用全部功能。Oligoprimer3ThePrimerGeneratorNetPrimer如何使用PrimerPremier5.0引物設計一般引物設計5’帶酶切位點引物設計巢式PCR引物設計多重PCR引物設計探針設計引物評析引物同源

8、性分析用Blastn軟件進行同源性比較盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物選擇3’端與非目的基因不同源的序列作為引物選擇兩個引物3’端與同一非目的基因不同源的序列作為引物