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《雞傳染性貧血病毒病LAMP快速可視化檢測方法的建立.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第32卷第6期家畜生態(tài)學報Vo1．32NO．62011年11月ActaEcologiaeAnimalisDomasticiNOV．2011雞傳染性貧血病毒病LAMP快速可視化檢測方法的建立鄧顯文，謝芝勛，謝志勤，劉加波，龐耀珊，謝麗基，彭宜，范晴(廣西獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室，廣西南寧530001)[摘要]為建立一種能快速檢測雞傳染性貧血病毒病(CIAV)的檢測方法，根據(jù)基因庫中雞傳染性貧血病毒病的保守序列，設(shè)計一套特異性環(huán)介導等溫擴增(LAMP)引物，建立了CI—Av的LAMP可視化檢測方法。該法敏感性可迭10fg，高于常規(guī)PCR方法10倍；全部反應可在lh內(nèi)完成；可通過
2、肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果；對其它雞常見病原體的檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明建立的LAMP方法簡便、快速、靈敏、特異，可用于CIAV感染的快速檢測。[關(guān)鍵詞]雞傳染性貧血病毒病；LAMP；檢測[中圖分類號]$811．6[文獻標識碼]A[文章編號]1005—5228(2011)06—0057—04雞傳染性貧血(chickeninfectiousanemia，雞傳染性貧血病毒病，為臨床檢測雞傳染性貧血病CIA)是由雞傳染性貧血病毒(CIAV)引起的以侵害毒的感染調(diào)查奠定基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外均未見有用雛雞為主的一種免疫抑制性傳染病，CIAV可引起3Calcein+MnCl2替代了SYBRGreen和G
3、eneFind—周齡以內(nèi)雞嚴重貧血、出血，骨髓和淋巴器官嚴重萎er建立的CIAVLAMP可視化檢測方法的相關(guān)報縮口]。臨床上CIAV感染雞群常伴發(fā)或繼發(fā)其它疾道，現(xiàn)將研究進展報告如下。病，甚至引起疫苗免疫失敗等。近幾年的流行病學1材料與方法調(diào)查表明，CAIV在我國雞群中的感染非常普遍，感染率高達4O～96l_2]。1．1病毒株目前CAIV檢測的主要方法有：PCR法[3-s]、地本研究所使用的雞傳染性貧血病毒Cux一1標準高辛或生物素標記CAIVDNA探針法、間接免疫過株、雞毒支原體(MG—S6)由美國康州大學Khan教氧化物酶分析法(1iP)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(in—授惠贈，2株CIA
4、V分離野毒株“]、傳染性支氣管炎directELISA)、阻斷式酶聯(lián)免疫吸附試驗(blocking病毒(H120)、喉氣管炎病毒(ILTV)、雞新城疫ELISA)、原位雜交(IsH)、間接免疫熒光試驗(IIF)病毒(NDV—Lasota)、禽流感病毒(H9)、馬立克等]，但是需要使用昂貴的儀器和試劑等。環(huán)介導(MD)、大腸桿菌(O57)、禽巴氏桿菌(C48—1)、雞白等溫擴增技術(shù)(1oop—mediatedisothermalamplifi—痢由本研究室保存。cation，LAMP)是由Notomi等[8建立的一種新型1．2引物設(shè)計核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)具有簡捷、成本低廉和結(jié)果可參照Genb
5、ank中CIAV的VP2基因序列，利視化等優(yōu)點，目前在一些病原微生物的檢測中被廣用PrimerExporerV4在線設(shè)計軟件，設(shè)計LAMP泛運用_9。本試驗用Calcein+MnCl。替代了引物，其中包括2條外引物F3／B3和2條內(nèi)引物sYBRGreen和GeneFinder構(gòu)建LAMP方法檢測FIP／BIP，以及2條用于提高擴增效率的環(huán)引物[收稿El期]2O11-11一o7[基金項目]廣西科技攻關(guān)項目(桂科攻0537008—3A；桂科攻1123007—4)；廣西特聘專家專項經(jīng)費(2011B020)；新世紀百千萬人才工程國家級人選專項經(jīng)費(945200603)[作者簡介]鄧顯文(1963)
6、，男，廣西賀州人，大學本科，研究員，主要從事禽病及動物分子生物學研究工作。E—mail：xianwendeng@yahoo．corn．cn*[通訊作者]謝芝勛(1963一)，男，廣西博白人，研究員，主要從事禽病及動物分子生物學研究工作。E—mail：xiezhixun@126．corn58家畜生態(tài)學報第32卷Bloop和Floop。引物由上海Invitrogen公司合成。pg、1Pg、100fg、10fg和1fg，用優(yōu)化好的LAMP1．3CIAVDNA的提取和模板的制備方法和常規(guī)PCR方法同時檢測，進而對兩者的敏感DNA(RNA)抽提：參照TIANgenDNA性進行比較。(RNA)提取試劑
7、盒說明書，抽提其DNA(RNA)，對2結(jié)果與分析照菌(毒)株的DNA(RNA)的抽提方法相同。制備CIAVDNA模板：用凝膠回收試劑盒純化2．1LAMP反應條件的優(yōu)化回收B3、F3的PCR擴增產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連人2．1．1反應溫度的優(yōu)化通過對反應溫度的優(yōu)化，pGM-18T載體，用PCR快速鑒定，陽性重組菌送最終確定該LAMP檢測方法的最佳反應溫度為62大連寶生生物技術(shù)有限公司進行測序，在GenBank464℃，加環(huán)引物
