間斷多次低溫對糖氧剝奪神經(jīng)元的保護作用

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1、南方醫(yī)科大學(xué)2010級博士學(xué)位論文間斷多次低溫對糖氧剝奪神經(jīng)元的保護作用Theneuroprotectivemechanismsoftheintermittenthypothermiaonoxygen·glucosedeprivatedneurons課題來源：國家自然科學(xué)基金(81271521)廣東省自然科學(xué)基金(10151051501000053)學(xué)位申請人導(dǎo)師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型培養(yǎng)層次所在學(xué)院徐隋意潘速躍教授神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)型博士南方醫(yī)院2013年4月25日廣州博士學(xué)位論文間斷多次低溫對糖氧剝奪神經(jīng)元的保護作用博士研究生：徐隋意指導(dǎo)教師：潘速躍教授摘要神經(jīng)保護劑的

2、動物實驗和人類臨床試驗結(jié)果差異較大。很多神經(jīng)保護劑在各種動物缺血性模型中被證明有效，但是沒有一個在人類III期臨床試驗有作用。通過回顧性分析人類神經(jīng)保護劑的隨機對照試驗(RCT)探討神經(jīng)保護劑臨床轉(zhuǎn)化失敗的原因，我們發(fā)現(xiàn)很多因素與之相關(guān)：模型選擇，麻醉劑選擇，生理學(xué)指標監(jiān)測，造模成功標準，栓子性質(zhì)，再灌注損傷，梗死面積，治療時間窗，藥物滲透性，血藥濃度，性別差異，結(jié)果評估等。而入院前“家庭藥物”超早期治療和多靶點治療或許是未來考慮的方向。低溫可以通過多靶點抑制缺血后損傷通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。頸動脈內(nèi)冰鹽水灌注(ICSI)是最快速的低溫誘導(dǎo)方式。我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)，

3、在大鼠缺血性卒中模型中低溫的治療時間窗比血管沖洗的作用時間寬。然而持續(xù)大量的ICSI來維持局部腦低溫會導(dǎo)致病人一些列的副作用。因此我們考慮將這種特殊的治療方法應(yīng)用于未來臨床時，我們意識到，為了在治療效果和減少持續(xù)ICSI大容量鹽水灌注的副作用方面權(quán)衡利弊，我們將其改良為間斷ICSI。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，與持續(xù)ICSI相比，間斷策略可以維持更長時間的低溫，對血細胞比容影響更小，可能為一種更有潛力的神經(jīng)保護手段。雖然前期研究顯示間斷多次低溫對大鼠大腦中動脈梗死(MCAO)模型有治療效果。間斷低溫的神經(jīng)保護機制仍不清楚。因此本實驗利用胎鼠皮層神經(jīng)中文摘要元糖氧剝奪模型來體外

4、模擬缺血性卒中，利用細胞模型高通量的特點比較不同低溫模式對神經(jīng)損害機制的影響，探討間斷多次低溫可能的神經(jīng)保護靶點。為篩選最優(yōu)的間斷低溫模式以及未來臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。第一章皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)胎鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)可以制作多種神經(jīng)疾病的體外細胞模型。但是胎鼠腦體積較小，解剖難度相對較大，皮層神經(jīng)元急性分離和培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)復(fù)雜，至今尚未有統(tǒng)一的操作路徑。因此探討一種簡便，合理，可重復(fù)性好的操作方法對于研究細胞模型至關(guān)重要。首先脫頸處死SPF級E18SD孕鼠，取出子宮和胎鼠。為了減少神經(jīng)元代謝，保證其活力，接下來的解剖過程在碎冰上進行。我們將傳統(tǒng)的斷頭后分離解剖頂端皮層改

5、良為經(jīng)鼻入路雙側(cè)對稱分離法進行解剖，縮短了胎鼠皮層的解剖時間。然后用體視鏡顯微剝離皮層腦膜和血管，以減少腦膜細胞和血管細胞等混雜細胞對神經(jīng)元純度的干擾。由于這個過程時間較長，顯微解剖在含有10％胎牛血清(FBS)和谷氨酰胺的HG．DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中進行以確保解剖過程中神經(jīng)元的能量代謝。將剝離干凈的胎鼠腦皮層置入含有冰HG．DMEM(不含F(xiàn)BS)的一次性3．5cm滅菌培養(yǎng)皿中，用滅菌的顯微解剖剪剪碎至約lmm。考慮到傳統(tǒng)的胰酶消化速度不好控制，我們用木瓜酶結(jié)合DNA酶I序貫消化。終止消化后，經(jīng)過巴氏管吹打和細胞篩過濾得到神經(jīng)元的單細胞懸液，用0．2％錐蟲藍染色以

6、確保細胞團塊要少于10％，死細胞數(shù)量小于1％。用0．Img／ml左旋多聚賴氨酸預(yù)包被過的培養(yǎng)瓶以50000／cm2的密度接種神經(jīng)元，4d,時后發(fā)現(xiàn)大部分細胞已經(jīng)貼壁。用neurobasal+B27+谷氨酰胺+青鏈雙抗的培養(yǎng)液換液后繼續(xù)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的神經(jīng)元通過DAPI染核，B．3．TUBULIN骨架蛋白免疫熒光鑒定。神經(jīng)元純度通過陽性細胞計數(shù)和流式細胞儀測量均提示大于95％，可以滿足進一步實驗需要。第二章糖氧剝奪模型制作及低溫干預(yù)方案缺血性卒中發(fā)生時，血液供應(yīng)減少導(dǎo)致病灶區(qū)營養(yǎng)和氧氣相應(yīng)剝奪。這是形成“核心”梗死灶和缺血半暗帶的重要原因。而這一過程可以用體外細胞卒I

7、I博士學(xué)位論文中模型來進行模擬。核心梗死灶中已經(jīng)死亡的神經(jīng)元沒有研究價值，而位于缺血半暗帶的神經(jīng)元是我們體外卒中模型研究的重點。越接近核心梗死灶，糖氧剝奪程度越重，而缺血半暗帶區(qū)糖氧剝奪程度相對較輕。因此我們可以通過精確控制神經(jīng)元培養(yǎng)液中的“糖”等營養(yǎng)成分來模擬糖剝奪。也可以通過厭氧培養(yǎng)箱來控制神經(jīng)元培養(yǎng)環(huán)境中的“氧”濃度來模擬氧剝奪。相應(yīng)的，如果缺血性卒中后期，責(zé)任血管發(fā)生再通或者是側(cè)支循環(huán)建立恢復(fù)供血，又會面臨著缺血再灌注損傷。而在體外細胞模型我們可以通過重新恢復(fù)神經(jīng)元培養(yǎng)液和氧供給來研究這一重要的病理生理過程。本實驗在神經(jīng)元糖氧剝奪模型的基礎(chǔ)上實施間斷多次