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1、萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院碩士學(xué)位論文摘要根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)BG。基因轉(zhuǎn)化花生的研究摘要花生是重要的油料兼經(jīng)濟(jì)作物,真菌病害是花生的主要病害,導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。單純依靠常規(guī)育種方法很難選育出對(duì)真菌病害高抗的品種。而利用遺傳轉(zhuǎn)化將外源基因?qū)牖ㄉ耘喾N則應(yīng)具有一定的可行性。本研究首先對(duì)花生組織培養(yǎng)植株再生方法進(jìn)行研究,建立了胚小葉高效再生體系,然后利用遺傳轉(zhuǎn)化體系,通過衣桿菌介導(dǎo)法,將B一1,3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入花生品種花育22,以提高花生抗病性。主要研究結(jié)果如下:l彳1用8個(gè)花生品種對(duì)花生組織培養(yǎng)進(jìn)行研究,結(jié)果表明:(1)基因型對(duì)再生率有很大影響,不同花生品種的愈傷組織形
2、成和不定芽發(fā)生有明顯的差異。(2)花生外植體對(duì)花生組織培養(yǎng)的植株再生具有很大影響,胚小葉的芽誘導(dǎo)率明顯高于子葉、胚軸、胚根等其它外植體。(3)胚一1-葉的葉齡對(duì)不定芽誘導(dǎo)有很大影響,萌發(fā)5、6天的種子的胚小葉有利于誘導(dǎo)不定芽的形成,其中萌發(fā)6d的胚小葉最高,芽誘導(dǎo)率為91.3%。(4)以花生胚小葉作為外植體用于組織培養(yǎng)離體再生,具有取材簡(jiǎn)單,來(lái)源豐富,再生率高的優(yōu)點(diǎn),可將其用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基固轉(zhuǎn)化。(5)不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽的伸長(zhǎng)有很大影響,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),添加4mg/LBAP的培養(yǎng)基,芽伸長(zhǎng)比較明顯,添加10mg/LBAP的培養(yǎng)基中芽叢生明顯。2.確定了krn的選擇
3、壓,芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加km最低濃度為50mg/L可有效抑制非轉(zhuǎn)化愈傷組織的形成或芽再生。添加500mg/LCb可有效抑制衣桿菌LBA4404的生長(zhǎng),且對(duì)花生外植體的再生無(wú)顯著影響。3,對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的適宜條件進(jìn)行研究,結(jié)果表明:(1)預(yù)培養(yǎng)3天的花生胚小葉外植體最適宜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。(2)菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大,以O(shè)D。,=O.1為最好。(3)適宜侵染時(shí)間為10一15mjn,轉(zhuǎn)化率較高。(4)農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間3d,轉(zhuǎn)化率較高。(5)種子萌發(fā)后6d的胚小葉為受體轉(zhuǎn)化效果最好。4.將D—l,3一葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入花生栽培品種。利用優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系,以萌發(fā)6d
4、的花生品種花育22的胚小葉為外植體,經(jīng)農(nóng)桿菌LBA4404侵染,Kin篩選和標(biāo)記基因PCR檢測(cè),得到目的基因轉(zhuǎn)化植株。5.確立了衣桿菌介導(dǎo)途徑進(jìn)行花生遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)規(guī)程:選用花生品種白沙1016或花育22的成熟飽滿的種子。經(jīng)表面消毒后,接種于催芽培養(yǎng)基上,取萌發(fā)6d的胚小葉,接種于MSB5+6.0rrI∥LBAP+I.0m∥LNAA培養(yǎng)基上預(yù)培萊Ⅲ農(nóng)學(xué)院碩士學(xué)位論文』l{:i要養(yǎng)3d。用活化的農(nóng)桿菌重懸浮菌液(OD㈣=0.4)浸染10—15rain,共培養(yǎng)3d,經(jīng)700mg/LCb浸泡沖洗后,轉(zhuǎn)接到MSB5+6.0mg/LBAP+I.0mg/LNAA+50Km
5、+500Cb篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。3w后,將帶抗性芽點(diǎn)的愈傷轉(zhuǎn)接到MSB5+10m∥LBAP+50Km+500Cb的再生篩選培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽。2w后將叢生芽轉(zhuǎn)接到MSB5+10mg/LBAP+50Km+500Cb的培養(yǎng)基上促進(jìn)芽的伸長(zhǎng),每2w繼代一次。當(dāng)芽伸長(zhǎng)到3-4cm,轉(zhuǎn)到MSB5+0.5mg/LNAA+50Km+500Cb培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。關(guān)鍵詞:花生(A.hypogaeaL.);再生體系;根癌衣桿菌;遺傳轉(zhuǎn)化;13—1,3葡聚糖酶基因(BG:)型圈叢堂墮堡:!望:焦堡塞.壘堡!!堡壘笪!StudiesofGeneticTransformationof
6、BG2GeneintoPeanut(ArachishypogaeaL.)MediatedbyAgrobacteriumtumefaciensAbstractPeanut(ArachishypogaeaL)isanimportantoilandcommercialcrop.butfugidiseaseisitsmainplantdisease,whichseriouslyreducesitsyieldandquality.Itisdifficulttosolvethisproblembytraditionalbreedingmethod,butitcouldpo
7、ssiblybesolvedbytransfonninganti—fugalgenetopeanutcultivars.Inthispaper,theefficientplantregenerationsystemofpeanuttissueculturewasestablished.Withthissystem,B一1,3-GlucnasegenemediatedbyA.tumefitcienswasintroducedintopeanutcultivarsHuayuNo.22Theresultswereshowedasbelow.1Thetissuecul
8、tureandefficientpla